聊聊你可能想要了解的 ELISPOT（酶联免疫斑点斑点法）实验

细胞因子常用的检测手段有很多，ELISA, 流式等等，今天就来讲讲不少同学还不是很熟悉的ELISPOT。

什么是 ELISpot？ 
-- Enzyme-linked immunoSpot assay，是用于在单细胞水平检测细胞因子(CK)分泌细胞和抗体分泌细胞(ASC)的一项细胞免疫学检测技术。ELISpot 原理类似于双抗夹心 ELISA,只是将 ELISA 实验中的上清换成细胞悬液+刺激物，在 ELISpot 板中培养细胞，最终每个会分泌细胞因子或抗体的细胞的位置，就会显色留下斑点印迹，通过专业的斑点成像仪器（如AID ELISPOT Reader）就可以进行计数和分析。

ELISpot 与 ELISA 有什么不同？  

区别	ELISA	ELISPOT
原理	都是基于抗原抗体反应，ELISPOT实际上就是双抗夹心ELISA的延伸和新的发展，可以看做单细胞水平的ELISA。
测定对象	样本中的某蛋白含量	分泌某种细胞因子或抗体的细胞频率
样品类型	悬浮液/上清	细胞培养
样品板	普通96孔板	覆PVDF膜96孔板
灵敏度	比ELISPOT低百倍	ELISPOT可精确到检测出几十万甚至百万个淋巴细胞中的一个活化细胞的细胞因子分泌。
检测设备及检测方式	ELISA Reader 通过显色反应，测吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量	AID ELISPOT Reader 通过显色反应，在分泌细胞因子的细胞位置显现清晰斑点，进行计数，从而计算出分泌该细胞因子的细胞的频率。
总结	某些研究不仅要测细胞因子的分泌量（ELISA），还需检测分泌此细胞因子的细胞频率（ELISPOT）。ELISPOT可以理解为单细胞水平的ELISA，原理和实验步骤类似，但是更加适用于T/B淋巴细胞功能的研究。

ELISpot 实验原理介绍：

实验需要准备：
96 孔覆 PVDF 膜的 ELISPOT 专用板（空白板子可以购自 Millipore），待测细胞因子的抗体对（如 IFN-r 纯化单抗，用于包被；ALP 标记的 IFN-r 单孔，用于检测；底物显色液。（试剂可以购自Mabtech,BD,RD等）。自动化的读板仪器，如 AID ELISPOT Reader。
当然，不差钱的实验室可以直接买预包被的 ELISpot 试剂盒，省去包被的时间，减少影响实验结果的又一可变因素，一般来说预包被试剂盒最终拿到的板子背景会更干净，斑点也会显色的更加清晰致密。

实验原理：


ELISpot 技术优势：
高灵敏度
单细胞水平
活细胞功能检测
细胞可回收利用

ELISpot 实验适用于检测比率较低的抗原特异性的T细胞免疫反应和B细胞免疫反应。
具体应用领域：T, B 细胞功能研究/感染性疾病研究、抗原决定簇图谱分析、化合物和药物免疫学反应的筛选、肿瘤研究、疫苗研发、自身免疫病研究、移植中排斥反应的预测、过敏性疾病研究等等。

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